背景:由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2 (SARS-CoV-2)引起的冠状病毒病2019 (COVID-19)是一种高度传染性疾病。感染COVID-19的患者会因宿主免疫反应而出现多种多样的症状，包括严重的呼吸道疾病、急性冠状动脉综合征和代谢紊乱。这种疾病背后的机制和为什么有些人是无症状携带者，而另一些患者则会出现严重的症状并导致死亡，目前尚不清楚，然而，许多最近的研究表明细胞因子风暴和免疫抑制与疾病的进展高度相关。了解宿主病毒反应生物学的重点是研究病毒感染时血液中宿主蛋白的全面蛋白质组分析，不仅是了解疾病的基础，还可以促进精准医疗，在治疗干预之前和期间对患者进行分层和监测。因此，用敏感和特异的方法来探测个体的循环血浆蛋白质组，需要大量样本。然而，从极小的样本量开始，对超过10亿种浓度范围内的数千种蛋白质进行量化的挑战阻碍了这方面的进展。

我们之前已经报道了基于邻近延伸分析(PEA)方法的健康个体的稳定和独特的血浆蛋白质组图谱。最近我们也展示了通过引入大规模并行测序(这里称为PEA-NGS)，它可以扩展并分析更多的目标，而不会干扰精确度和灵敏度。这种用于“下一代血浆图谱”的新方法允许从少量样本中同时分析近1500个蛋白质靶标，并促进灵敏的多重分析与低交叉反应性和最小限度的偏离目标蛋白。一些基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的研究也对轻、重度新冠肺炎感染患者的血浆蛋白质组进行了研究。这两个平台使用两种不同的方法处理蛋白质组，其中LC-MS/MS是一种系统范围和无偏倚的方法，而PEA技术是一种高度灵敏和有针对性的方法。重要的是，这两种技术可以测量不同的蛋白质群体，尽管重叠本来就很小，但当同一目标在不同的个体上被量化时，它们通常是相互支持的，并显示出高度的相关性。

在这里，我们使用蛋白质组分析技术研究了具有轻中度症状的新冠肺炎患者的血浆蛋白质组图谱，以便对感染引起的蛋白质反应进行全面比较。这一结果支持了之前发表的主要涉及严重或危重患者群体的研究，我们的研究允许比较症状严重程度不同的患者群体中的蛋白质图谱模式。在这里，我们包括了迄今为止针对轻中度患者组研究的最大数量的靶蛋白，这些蛋白在疾病开始时以及康复14天后进行了分析。

方法：从93名18岁以上的临床试验队列中随机挑选了50名患者，这些患者在过去24小时内鼻拭子聚合酶链反应新冠肺炎检测呈阳性，病情稳定，不需要住院。做了胸部断层扫描以排除肺炎。排除部分血氧饱和度低于93%并在确诊后需要住院的患者。诊断当天开始治疗。所有患者在第14天进行新冠肺炎聚合酶链反应检测，结果均为阴性。我们分析了这些轻、中度症状COVID-19患者的血浆蛋白谱，将新诊断患者的血浆蛋白水平与14天后同一个体的血浆蛋白水平进行比较。

结果:该研究已经发现超过200种蛋白质在感染期间显著升高，其中许多与细胞因子反应和其他免疫相关功能有关。与COVID-19疾病最显著相关的蛋白是清除率受体B类成员2 (SCARB2)，这是一种参与病毒进入的宿主细胞受体蛋白。与BMI高度相关的蛋白质是瘦素(leptin, LEP)。钙粘蛋白相关家族成员2 (CDHR2)是最显著的性别相关蛋白，也与BMI相关。在我们的队列中，胞外发育不良蛋白A2受体(EDA2R)与年龄高度相关，表明该蛋白是与衰老有关的。COVID-19感染样本中差异表达的蛋白在感染期间几乎全部上调，包括许多与细胞因子反应相关的蛋白，如干扰素lambda 1 (IFNL1)和趋化因子C-XC基序趋化因子配体10 (CXCL10)和C-C基序趋化因子配体8 (CCL8)。已知在肿瘤形成和炎症宿主反应中发挥作用。研究还发现了与其他免疫相关功能相关的蛋白质，包括唾液酸结合的Ig，如凝集素1 (SIGLEC1)，其功能是巨噬细胞限制粘附分子，以及淋巴细胞激活3 (LAG3)，其功能是抗原激活t细胞的抑制受体。在感染期间，只有两种蛋白质被发现显著下调:(i) C-C基型趋化因子配体24 (CCL24)，这是一种参与炎症反应的细胞因子，是静息T巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化因子;(ii) TNF受体超家族成员10c (TNFRSF10C)，是细胞毒性配体TRAIL的受体。与严重症状患者血浆蛋白反应的比较显示出高度相似的模式，但也有一些有趣的差异。

图1 研究队列概述。(a)研究设计，包括来自S3WP项目的COVID-19队列和健康队列，均使用PEA-NGS方法进行分析。(b) COVID-19队列的年龄分布(n = 33，男性;N = 17，女性)。(c) COVID-19队列的BMI分布。(d)图中显示COVID-19队列中每个个体的症状以及年龄、症状阳性天数和测量的氧饱和度(SPO2)水平，以百分比(%)表示(n = 50)。

图2 COVID-19样本聚类。(a) UMAP图，显示第0天和第14天样本的分布，每个样本用虚线连接。(b)可视化所有样本分层聚类结果的树状图。第0天的样本用红色表示，第14天的样本用蓝色表示。

图3 与COVID-19感染相关的蛋白质。(a)基于COVID-19感染(第0天/第14天)、年龄、性别和BMI等因素的多因素方差分析结果，显示与每个因素相关性最高的蛋白(n = 50)。(b) BMI-(调整p<0.001)和性别相关(调整p<0.001)蛋白钙粘蛋白相关家族成员2 (CDHR2)的例子(n = 50)。(c)年龄相关蛋白胞外发育不良蛋白A2受体(EDA2R)的例子(调整p<0.001, n = 50)。(d)第0天和第14天样本之间差异表达蛋白的火山图，显示x轴上NPX值的差异，y轴上-log10(调整后的p值)的差异(多因素方差分析与Benjamini Hochberg校正，n = 50)。我们将前50个最重要的蛋白质手工标注为“细胞因子”(红色)、“免疫相关”(橙色)和“其他”(蓝色)。(e)第0天样本中蛋白质上调和下调的箱线图(n = 50)。

表 COVID-19感染患者血浆蛋白升高前50名

图4 COVID-19感染相关血浆蛋白分析。(a)根据50个蛋白的表达进行聚类，显示第0天和第14天样品中50个最显著蛋白的表达水平。(b)散点图，x轴表示我们研究中第0天和第14天样本的表达水平差异，y轴表示Filbin等研究中COVID-19阳性和阴性样本的表达水平差异。所有在我们的研究中有显著差异的蛋白质都显示出来了。在Filbin等人的研究中，颜色代码表示-log10调整后的p值，其中灰点表示无显著变化。统计分析是基于方差分析，性别，年龄，bmi为协变量。(c)我们的研究(n = 50)和Filbin等人的研究(n = 242，阳性;N = 78，阴性）。

图5 分析与COVID-19感染高度相关的50种蛋白质。(a)雷达图显示三组样本(红色为第0天，蓝色为第14天，绿色为健康健康队列)中每组50个蛋白质的平均表达水平。(b)箱线图显示COVID-19和健康研究中两种差异表达蛋白外核苷三磷酸二磷酸水解酶5 (ENTPD5)和小管间质性肾炎抗原1 (TINAGL1)的表达水平(n = 50, COVID-19研究;N = 76，健康研究)。(c) UMAP图显示基于前50种蛋白质的COVID-19队列和健康队列的76个样本的分布。(d) UMAP图突出了两组不同的第14天样本中个体的年龄。(e)基于配对t检验的两组不同day14样本的年龄分布和p值的箱线图(调整p<0.001, n = 50)。(f)箱线图显示差异表达的唾液酸结合Ig like凝集素1蛋白(SIGLEC1)在第0天样本、第14天样本的第1组(G1)和第2组(G2)以及健康队列(n = 50, COVID-19研究)中的蛋白水平分布;N = 76，健康研究)。

结论:本研究证明了“下一代血浆蛋白谱分析”在识别疾病进展的重要分子特征以及在感染恢复期间监测疾病方面的有效性。这一结果将有助于进一步研究SARS-CoV-2病毒免疫应答的分子机制。

原文出处：

Zhong W,  Altay O,  Arif M,et al.Next generation plasma proteome profiling of COVID-19 patients with mild to moderate symptoms.EBioMedicine 2021 Nov 26;74